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          羊肚菌的菌種分離與制作——組織分離

          發布時間:2020-07-10

            來源:中國食用菌商務網

              組織分離是最常用的分離方法。該方法較孢子分離相對簡單,獲得的菌種性狀相對穩定,分離后代的基因型和親本基因型一致,可以在一定的世代范圍內傳承親本的優良性狀,因此組織分離是目前應用最廣泛的分離手段,也是一些菌種定向選育的篩選方法,但是并非組織分離法適用于所有材料。經驗表明,一些種類的組織分離物,絕大多數豐產性有所下降,如平菇、雙孢菇等。長期從事羊肚菌的朋友一定也發現過,你采集的新鮮標本,存在著一定概率完全分離不出來的情況,這就是羊肚菌組織容易老化的一個表現,老化的菌株肯定是不能用于生產的。
              組織分離的具體方法是:取半成熟至成熟的健壯新鮮子實體,0.1%升汞或75%酒精表面消毒。如果是干標本,則用無菌水振蕩沖洗、泡開后用再升汞或酒精進行消毒處理。在消毒之前,還可以用吹風機冷風吹去表面的附著物和雜菌,用升汞或酒精表面擦洗,特別是菌柄部分。在無菌條件下從子實體中間縱向掰開,用尖嘴鑷子或解剖刀小心取菌蓋與菌柄交界處或菌肉厚的部分(即遠離組織表面)約1~3mm大小的菌肉組織,置于適宜培養基上,在適宜溫度下培養。當菌落長至直徑1 ~ 2 cm時進行轉管純化。
              下面根據羊肚菌的特點詳解羊肚菌的組織分離步驟:
              1)用具和材料準備:酒精燈、打火機、75%酒精棉球、解剖刀、尖嘴鑷子、頓口鑷子、挑針或接種針、無菌吸水紙或濾紙、75%的酒精或0.1%的升汞(氯化汞)溶液、無菌蒸餾水、斜面試管或倒好培養基的平板、超凈工作臺,以及待分離的新鮮羊肚菌子囊果。
              2)將上述用具置于超凈工作臺中,開紫外燈,表面殺菌20 ~ 30 min;之后關閉紫外燈,放入待分離的子囊果標本;打開風機,中高檔風速吹風5~10 min。
              3)打開超凈工作臺白熾燈,風速可以減少到中低檔位;用75%的酒精棉球擦拭雙手,進行表面消毒,再用新鮮的75%酒精棉球對超凈工作臺臺面進行擦拭。
              4)用略干的酒精棉球將子囊果菌柄特別是基部與土壤交界處的灰塵或泥土擦拭干凈,擦拭過程中及時更換酒精棉球;將擦拭干凈的子囊果用解剖刀切取菌柄0.5×1 cm組織塊2~3塊,或取菌柄與菌蓋交接處組織較厚的部位;將組織塊置于0.1%的升汞溶液內浸泡0.5 ~ 1 min(或75%的酒精內浸泡2 ~ 3 min),根據材料不同,需要調整浸泡時間,可以先從短時間開始,依次檢查效果,避免升汞或酒精將羊肚菌菌絲全部殺死。
              5)取出浸泡在升汞或酒精溶液中的組織塊,置于無菌蒸餾水中漂洗1 min,取出后置于無菌的吸水紙上,吸干水分。
              6)用干凈的尖嘴鑷子或解剖刀撕開菌肉,盡可能取內部組織0.2~0.3 mm³,置于斜面或平板培養基上;或直接用解剖刀切取組織菌肉0.3~0.5 mm³,置于斜面或平板培養基上。
              7)斜面口朝上或平板封口后倒置,20~23℃恒溫培養箱培養。
              8)36~48h后,檢查接種塊是否萌動。初始的萌發菌絲稀疏,一根根清晰可見,長約0.2~0.4 cm,菌絲粗壯;56~72h后,成功萌發的菌絲將長至0.5~1.5cm長,菌絲纖細,無色,不濃密,前端近似整體,根根分明,此時可挑取菌落尖端進行挑出純化或再等最多一天后挑出純化。
              9)純化的羊肚菌8 ~ 12h左右,可見到從接種塊萌發到培養基上的新生菌絲,初始的新生菌絲形態和8)所述狀態一致,稀疏、無色、薄、根根分明;通常18×180 mm的斜面試管,4 ~ 5d左右可長滿試管,具有一定的爬壁能力,此時,培養基表面的菌絲密度較之前明顯增大,試管壁上有一層稀疏但明顯的菌絲物,菌落前端略整齊,有齊頭并進之勢。4 ~ 7d間,開始在培養基表面形成白色、針尖狀、不規則顆粒狀,約直徑1mm左右的白色菌核,依據所分離品種的不同,菌核呈分散狀或凝集呈片狀。7 ~ 10 d,菌核有初始的白色、小,逐漸變淺黃變大,依據品種不同,菌絲開始出現少許色素,菌絲開始有初始的無色、白色至淺黃色、淺棕黃色。
              10)10 ~ 14 d的培養時間,將培養物移入4℃冰箱保藏備用。
              對于干標本的材料,可以用無菌水泡脹后按新鮮標本操作流程進行分離,但難度比新鮮標本大得多。
              對于比較干凈的幼嫩組織材料,可以略過升汞浸泡流程,在表面去雜消毒后,用解剖刀劈開子囊果,盡可能取不接觸空氣的組織進行分離,技術嫻熟者依舊可以達到非常好的效果。(來源:羊肚菌生物學與栽培技術)

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